DEL for 共价配体的发现

虽然历史上偶然发现了许多共价药物，但由于共价抑制剂对检测的干扰和可能缺乏选择性带来毒性问题，过去人们对共价抑制剂的开发并不热衷。随着近几十年的发展，共价抑制剂的合理设计受到了越来越多的关注，主要归功于其药效更强、靶向作用时间更长、选择性更高，以及对某些对可逆抑制剂耐药的突变体更加有效。

共价配体发现方法

通过在适当位置加入反应弹头，可逆配体可被合理设计成共价抑制剂。可逆部分提供结合亲和力（Ki），而亲电部分则与特定氨基酸（半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸等）发生反应，提供共价相互作用（Kinact）。表皮生长因子受体（EGFR）和Bruton酪氨酸激酶（BTK）共价抑制剂的发现也采用了这种策略，即首先发现配体，随后加入迈克尔受体亲电体（图 1）。

图1. 共价药物实例。

直接筛选共价化合物库也为共价配体的发现提供了一种有效的策略，KRAS G12C最初的苗头化合物的发现就是一个典型的例子，其导致了最终开发成功的上市药物索托拉西布（AMG510，图 1）。质谱法、基于活性的蛋白分析法（ABPP）以及共价DNA编码化合物库（DEL）是主要的实验手段。前两种方法虽然简单易行、选择性好，但通量相对较低，而共价 DEL 筛选则具有通量高、成本低和能够快速研究大化学空间的独特优势。在这方面，成都先导在共价筛选上进行了全面的探索，包括共价库设计、筛选条件优化和化合物表征，并取得了多项共价库筛选的成功。

成都先导的共价DEL

成都先导的共价DEL分子由两部分结构组合而成：第一部分是数百万个能提供一定非共价结合活性与选择性的DNA编码的可扩展中间体；第二部分是可提供共价结合的数十个结构与机制各异的亲电基团。通过条件温和的DNA/亲电基团兼容的化学反应，两部分结构连接在一起，生成完整的共价DEL（图2.库设计示意图；图3.代表性的off-DNA分子结构）。其中，可扩展中间体部分由数百个成都先导独有的骨架与超过3万个各种不同类型的分子砌块，通过多种化学组合而成，从而保证这些中间体结构具有足够的新颖性、多样性以及类药性。根据作用机制的不同，成都先导对数十个亲电基团进行了分类，从而能针对性地用于不同的靶点蛋白。例如，当靶标蛋白含有半胱氨酸时，我们会选择由迈克尔受体以及其他的针对半胱氨酸的亲电基团构建的共价键库来进行筛选。在可拓展中间体上引入共价基团能带来两个好处：一是在中间体结合活性没那么强的时候通过共价反应增强分子的结合能力，从而增加直接找到先导化合物的概率；二是不同结构的共价基团也可通过某些作用进一步产生选择性。除了专门针对半胱氨酸的共价DEL，成都先导还能提供针对赖氨酸、丝氨酸等氨基酸残基的共价DEL。

图2.成都先导共价DEL设计

为了保证筛选结果的可靠性，成都先导对共价基团的稳定性与活性都进行了相应的验证。稳定性验证结果表明我们选用的亲电基团能在DEL的合成、纯化、储存及筛选过程中保持结构稳定。我们也会通过定期重复地对某些靶点进行筛选，以确保共价库亲电基团的反应活性和整体活性。

图3.部分库分子的off-DNA结构（亲电基团标记为红色）

共价配体的合适靶点

l  靶向在ATP结合位点附近含有非保守半胱氨酸的激酶，以提高药效，并在某些情况下克服突变导致的耐药性（如EGFR、BTK、JAK3）。

l  靶向具有关键催化亲核氨基酸的蛋白酶（如去泛素酶、SARS-CoV-2主蛋白酶）。

l  以催化过程中会形成半胱氨酸-泛素共轭物的蛋白为靶标（如E2、HECT和RBR E3等）。

l  以结合口袋中或附近含有半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸或苏氨酸的其他靶蛋白为靶标，开发抑制剂或将其转化为降解剂。

共价筛选

鉴于共价化合物“结合与反应”的性质，共价DEL库筛选是在多种条件下进行的，以确保能区分出真正同靶蛋白结合且与特定亲核氨基酸反应的化合物。在筛选之前，还原剂、库投入量、库大小和孵育时间等实验条件应予优化。此外，使用阳性对照-DNA共轭物、亲核残基突变体和共价工具化合物阻断等条件也能增加筛选到活性化合物的信心。成都先导对共价筛选条件进行了广泛的探索（图4），对共价库筛选有着全面理解，并获得了成功的筛选案例。

图4. 共价库筛选探索（还原剂选择、DEL 库大小比较、孵育时间选择、抑制剂阻断和突变体比较）。

案例研究：半胱氨酸蛋白酶抑制剂的鉴定

图5. 共价库筛选计划、筛选结果、时间依赖的抑制确认以及与半胱氨酸共价结合的结构确认。

共价配体的表征 

与传统的可逆抑制剂相比，共价化合物的表征具有一些独特之处。首先，共价化合物表现为非线性的酶活-时间反应曲线，其抑制活性也有典型的时间依赖特征，从而影响了使用IC50进行共价化合物分析和排序的准确性。Kinact/Ki是一个更有意义的参数，是共价化合物表征和构效关系（SAR）分析的关键指标。此外，结合的不可逆性还可以通过质谱分析、稀释实验、透析和突变蛋白来验证（图6）。

图 6. 代表性的共价化合物验证方法。

展望

利用共价配体直接抑制挑战性靶点已成为现代药物发现领域极具吸引力的方法。共价DEL库筛选具有化学空间大、材料消耗少、筛选效率高的特点，将成为推动这一领域发展的有力方法。成都先导拥有经过严格验证的超10亿的大规模共价DEL库、丰富的筛选经验和全面的共价分析能力，可极大地助力加快您的共价配体发现工作。