先导科普荟 | 小核酸药物体内外评价推进药物研发进程 发布时间：2026-01-16

前言

小核酸一般是指长度小于30nt的寡核苷酸，通过作用于mRNA，干预靶基因表达以实现治疗目的。根据自身结构、作用机制、目标靶点的不同，小核酸分为多种类型，如小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）、反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide，ASO）、适配体（Aptamer）、微小RNA（Micro RNA，miRNA）等，其中已上市和临床阶段研究的小核酸药物以siRNA和ASO为主^[1]。小核酸药物凭借治疗效率高、靶向特异性好、药效持久、药物毒性小、治疗领域广泛等优点持续成为药物研发的热点^[2]。

随着小核酸药物的化学修饰和递送系统技术不断进步，开发小核酸药物代谢和药代动力学（DMPK）分析方法的需求日益增长。成都先导药物开发股份有限公司（以下简称“成都先导”）生物分析平台凭借丰富的创新药物分析经验以及先进的分析仪器，充分利用LC-MS/MS/HRMS分析技术，建立了化学合成小核酸药物和天然siRNA体内外代谢稳定性模型和体内血浆PK、组织分布测定方法，助力于小核酸药物临床前研究。

正文

ASO通常为13-30个核酸序列片段，该序列与靶序列互补，特异性结合mRNA，抑制靶蛋白表达；siRNA是通常含有19-23个碱基对的双链RNA片段，创新型超长链siRNA常大于40个碱基对，siRNA进入细胞后，细胞质内的Ag02酶会将siRNA的正义链裂解，反义链会装载到RNA诱导的沉默复合体（RISC），与靶mRNA特异性结合使其降解，从而抑制蛋白表达。

目前上市ASO和siRNA药物主要是被血浆和组织中核酸内切酶和核酸外切酶所代谢，而不是被小分子药物代谢过程中的肝脏I相和II相代谢酶代谢^[3]，因此寡核苷酸需要稳定的结构。提高稳定性的常见修饰有PS修饰（磷酸二酯键的氧原子被硫原子取代）、核糖修饰如2’-O-甲基（2’-OMe）、2’-O-甲氧基乙基（2’-MOE）、2’-氟（2’-F）、2’4’锁核酸（2’4’LNA）等，碱基修饰如嘧啶5’-甲基、5’-溴、5’-碘等，通过化学修饰抵抗核酸酶的降解，并提高与靶mRNA结合能力^[4]。

ASO和siRNA药物进入体内后主要分布于肝脏和肾脏中，根据不同靶点还需要进行递送基团的修饰或递送载体的保护才能进入靶器官，如胆固醇修饰^[5]、亲脂性修饰^[6]、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联^[7]、纳米脂质体（LNP）递送载体^[8]和RGD肽偶联等。

在小核酸序列筛选和优化阶段，需考察目标序列体外代谢水平，为结构优化提供依据，由此来评估核酸序列在体内的代谢情况。成都先导生物分析平台建立了常规链和超长链的小核酸系列体内外代谢研究体系，涉及大小鼠、食蟹猴等各种属血清、血浆、肝S9、溶酶体、核酸酶、脑脊液、T细胞悬液、肝、肾、肺、脑、脑皮层、脑海马体、皮肤、脂肪等基质或组织匀浆的稳定性和组织分布，应用于小核酸的临床前研究。

一、体外稳定性

核酸酶

核酸酶可以切割核苷酸链连接的磷酸二酯键，属于水解酶。从链的一端水解单核苷酸称为外切酶；从链内部水解磷酸二酯键的酶称为核酸内切酶。本平台选取内切酶RNase A，考察siRNA1（阴性序列）、siRNA2（阳性序列）和siRNA3稳定性，结果显示siRNA2和siRNA3未被RNase A水解，而siRNA1被迅速降解。实验结果见图1。

图1：siRNA1、siRNA2和siRNA3核酸酶RNase A体外稳定性

溶酶体

小核酸药物分子量大、极性大，不易被动扩散穿透细胞膜，需要内吞进入细胞，并由内体输送至溶酶体。溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器，内含多种水解酶，是小核酸药物重要的代谢场所。为避免小核酸在溶酶体环境快速代谢，需对小核酸进行化学修饰或借助递送系统。比如，GalNAc递送系统精准肝脏靶向递送，siRNA在肝细胞质中积累，以达到有效的治疗浓度。因此，在小核酸药物合成设计后，对其在溶酶体代谢的考察十分关键。依据文献报道^[9]，溶酶体在酸性环境中水解酶活性最佳。本平台模拟溶酶体作用环境，考察了siRNA1（阴性序列）、siRNA2（阳性序列）和siRNA3在SD大鼠肝溶酶体中的稳定性，以及酸性缓冲液对核酸稳定性的影响。试验结果显示，siRNA1的SS链在溶酶体中48h剩余量低于10%，在酸性缓冲液中较为稳定；AS链在溶酶体和缓冲液中均较为稳定。同时，siRNA2和siRNA3的AS链和SS链在溶酶体和缓冲液中均较为稳定，结果见下图2。

图2：siRNA1、siRNA2和siRNA3的AS链和SS链在SD大鼠肝溶酶体和缓冲液体外稳定性

肝S9

肝脏S9是肝组织去除匀浆沉淀物后的含有代谢所需成分、具有完整代谢功能的混悬溶液。相对于微粒体和胞质液，S9包含了完整的I相和Ⅱ相代谢酶的活性，能更完整地用于药物的代谢研究。本平台运用睾酮作为小分子阳参评估肝S9体系的活性，考察siRNA1和siRNA2的代谢情况，经过48h孵育，结果显示肝S9体系具有良好活性，siRNA1和siRNA2的SS链均有明显降低，AS链较为稳定，如图3所示。

图3：siRNA1和siRNA2食蟹猴肝S9稳定性

血清/血浆

血清/血浆常作为药物体外稳定性研究的生物基质，评估药物在血液循环系统中的稳定性。本平台对siRNA1（阴性序列）、siRNA2（阳性序列，Inclisiran）和siRNA3在ICR小鼠血清中72h和人血浆48h体外稳定性进行了分析，结果显示siRNA1在48h后原型已代谢至检测限以下，显示较为不稳定；siRNA2与siRNA3在72h后AS和SS原型均大于80%，显示较为稳定，实验结果见下图4。siRNA2（Inclisiran）在人血浆中孵育48h后AS和SS均无明显变化，较为稳定。

图4：siRNA1、siRNA2和siRNA3 ICR小鼠血清体外稳定性

图5：Inclisiran人血浆体外稳定性

肝匀浆

肝组织匀浆液含丰富酶系，肝匀浆体外代谢研究与体内代谢具有较强相关性^[10,11]，本平台考察了阳参序列Inclisiran在不同pH缓冲液和不同浓度食蟹猴肝匀浆中的代谢情况，其代谢情况与文献报道数据相近^[12]，确认最合适的肝匀浆代谢体系，结果如图6所示。

图6：Inclisiran食蟹猴肝匀浆和Buffer体外稳定性

肺匀浆

随着小核酸药物迅速发展，新的靶点和更多的适应症相继出现，对体外稳定性评估模型种类的需求日益增长。针对肺靶向siRNA，本平台建立了肺匀浆稳定性模型，考察了siRNA阳参序列在食蟹猴肺匀浆和缓冲液144h后的代谢情况，食蟹猴肺匀浆稳定性考察结果见图7。

图7：siRNA食蟹猴肺匀浆和缓冲液体外稳定性

二、血浆pK

平台研究了分子量约12KDa的常规siRNA链和34KDa的超长链siRNA1、siRNA2的AS和SS在血浆中的PK。结果显示，在小核酸给药（静脉或皮下）后，其血浆浓度含量较低，半衰期较短^[12]，但药效持续时间较长，生物利用度与药效相关性较差，血浆PK不能完全反映靶组织分布和药效学特征。因此，对组织分布的研究显得尤为重要。超长链siRNA1的AS和SS在血浆中的线性见图8；常规siRNA2的AS链、SS链及其主要代谢产物AS’N-1在血浆中的含量结果见图9。

图8：超长链siRNA1的AS和SS在血浆中的线性

图9：血浆中siRNA-AS、siRNA-SS和siRNA-AS’N-1(代谢物)含量测定

三、体内组织分布

小核酸药物在体内的分布受递送系统的影响，研究过程中根据不同递送系统会进行相应的靶部位核酸含量检测。寡核苷酸药物分析过程中存在极性大、含量低、回收率低、非特异性吸附、稳定性差、金属离子加和、色谱柱不耐用等挑战。因此，从生物基质中提取ASO或siRNA的过程中，要求尽可能减少生物样本中蛋白和其他物质的干扰，同时需保持核酸稳定。成都先导生物分析平台开发了多种类型小核酸如ASO、siRNA和超长链siRNA在大小鼠和食蟹猴的血浆、肝、肾、肺、脑、脑皮层、脑海马体、皮肤、脂肪等基质中的生物分析定量方法，方法验证结果满足回收率>95%、线性R>0.99、准确度85~115%、定量限LOQ 0.1~3nM等要求。ASO在小鼠肾组织中的线性及给药后组织分布结果见图10；siRNA1-GalNac的AS和SS在肝组织中的线性和给药后肝组织含量见图11。

图10：ASO在小鼠肾组织中的线性及给药后组织分布

图11：siRNA1-GalNac的AS和SS在肝组织中的线性和给药后肝组织含量

四、代谢物分析

小核酸在筛选阶段进行体外稳定性研究后，需考察在体内模型的代谢情况，以对比体内外差异。本平台在血浆和组织样本上具备成熟的HRMS高分辨质谱分析方法。对于常规siRNA链及超长链siRNA在小鼠和食蟹猴血浆、肝、肾、肺、脑、脑皮层、脑海马体、皮肤、脂肪等组织中的代谢物分析，成都先导拥有丰富的小核酸LCMS分析方法开发和代谢物解析经验，为小核酸的临床前药代药效评价提供可靠的数据依据。siRNA给药食蟹猴后，该siRNA的AS和SS链在3’N和5’N被不同程度酶切，产生了丰富的代谢产物，其血浆和肝组织中各代谢物占比见下图12。

图12：siRNA在食蟹猴体内血浆和肝组织代谢产物

五、总结

成都先导生物分析平台建立了小核酸药物体外代谢评价体系，以及体内血浆PK、组织分布等多个生物分析模型，并制定了严格的生物分析标准操作规程。本平台在多种修饰和递送小核酸药物的色谱质谱分析方面具有丰富的经验，可根据不同靶点建立相应的小核酸药物体外代谢体系，为客户提供全面的、定制化的生物分析解决方案。成都先导生物分析平台相关小核酸生物分析能力见下方表1。

六、参考文献

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