科技前沿 | 通过半胱氨酸的环化反应和酰胺缩合反应构建DNA编码的双环肽化合物 发布时间：2025-11-19

近日，成都先导药物开发股份有限公司报道了一种通过半胱氨酸的环化反应和酰胺缩合反应构建DNA编码的双环肽化合物的新方法。该反应策略包括在DNA上组装带有半胱氨酸前体的多肽，半胱氨酸与3,5-双(溴甲基)苯甲酸甲酯发生环化反应生成单环化合物，然后与分子砌块进行反应，随后通过水解和酰胺键的环化反应，高效构建具有多种氨基酸序列和多种环系大小的on-DNA双环肽化合物。目前相关研究成果《Synthesis of DNA-Encoded Bicyclic Peptides via Cysteine-Promoted Cyclization and Amide Condensation Reaction》发表于《Bioconjugate Chemistry》。

文章地址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.bioconjchem.5c00455

双环肽通常被定义为具有两个环状结构的肽类化合物，广泛存在于天然产物中¹，如α-Amanitin、向日葵胰蛋白酶抑制剂（SFTI-1）和Romidepsin（图1）。与线性或单环的肽类化合物相比，双环肽²的结构刚性更强，从而展示出更强的代谢稳定性和对靶标的结合亲和力/选择性。双环肽独特的理化性质，包括它们的大尺寸结构和受约束的双环构象，使它们在具有挑战性的靶点中表现出独特的优势，比如蛋白-蛋白相互作用³，因此双环肽受到了学术界和工业界的更多关注，期望找到更好的蛋白捕获剂。

图1：自然界中发现的双环肽

DNA编码化合物库（DEL）技术最早是由Brenner和Lerner教授于1992提出⁴。经过多年的发展，DEL技术目前已成为快速发现先导化合物和临床候选药物的平台⁵。该技术不仅可以用于小分子配体发现，还可以用于环肽配体的发现⁶。鉴于双环肽是介于小分子和生物制剂之间的一个重要的化学领域，其作为一种有前景的治疗药物受到了广泛的关注。双环肽与DEL的结合可以为药物开发提供巨大的潜在价值。因此，开发一种高效构建DNA编码的双环肽的方法具有重要意义。

成都先导的团队经过研究，成功在DNA兼容的条件下通过半胱氨酸的环化反应和酰胺缩合反应构建DNA编码的双环肽化合物（图2）。该策略包括在半胱氨酸前体上组装肽链、半胱氨酸与三官能团连接体的环化反应、分子砌块的缩合、水解和酰胺关环反应。通过该策略可以快速得到具有不同环系大小和不同肽序列的on-DNA双环肽化合物。

图2：双环肽的合成策略

成都先导的团队首先选择了一种在噬菌体展示技术中常用的1,3,5-三(溴甲基)苯3a⁷来合成双环肽化合物。团队通过on-DNA半胱氨酸与1,3,5-三(溴甲基)苯的反应，以70%的转化率得到了on-DNA双环肽化合物4a（图3）。然而，当合成含有S-叔丁基巯基-半胱氨酸的线性肽中间体时，伴随着-38 Da副产物的生成。团队推测-38 Da副产物可能是由于S-叔丁基巯基-半胱氨酸在碱性条件发生β-消除，随后与哌啶发生亲核加成反应得到⁸。考虑到两端带有S-叔丁基巯基-半胱氨酸的线性肽在De-Fmoc条件下的不稳定，会使得线性肽环化前体的合成变得困难，因此限制了该方法在构建高质量化合物库中的应用。

图3：使用1,3,5-三(溴甲基)苯合成双环肽的方法

为了避免带有S-叔丁基巯基-半胱氨酸的线性肽在De-Fmoc条件下生成副产物，团队改变了合成策略，在合成出带有S-叔丁基巯基-半胱氨酸的线性肽后立即进行环化反应，含有双硫醚的单环化合物可以作为第二次通过酰胺键进行环化的起始物料。随后，团队选择了3,5-二（溴甲基）苯甲酸甲酯3b来合成双环肽化合物。团队以HP-NH2为原料，依次与S-叔丁基巯基-半胱氨酸、三肽、四肽和S-叔丁基巯基-半胱氨酸的缩合反应合成了第一次环化的线性前体5a。将5a置于DTT/哌啶条件下⁹进行脱保护得到硫醇，随即与3b发生反应以73%的转化率得到单环肽6a（图4-1）。随后以单环肽6a为起始原料，经三肽和四肽的缩合反应、水解反应、DMT-MM介导羧酸与胺的环化反应¹⁰，以88%的转化率得到双环肽化合物7a（图4-2）。

图4：经过两次独立的环化反应合成双环肽的策略

在上述通过半胱氨酸的环化反应和酰胺缩合反应构建DNA编码的双环肽化合物的路径得到验证后，团队探究了双环肽的底物适用范围（图5）。所有的on-DNA双环肽都是以HP-NH2为起始原料，经氨基酸/肽类分子砌块缩合，半胱氨酸促进的环化反应，氨基酸/肽类分子砌块缩合，水解和第二次环化反应，高效地构建一系列具有不同肽序列和不同环系大小的on-DNA双环肽化合物。环状体系中氨基酸的个数[m+n]（m代表第一个环中氨基酸个数，n代表第二个环中氨基酸个数）范围从4到15个，合成了具有结构多样性的双环肽。令我们高兴的是，最小环尺寸的[2+2]-双环肽7b和7c可以以68%-75%的转化率得到，最大环尺寸的[7+8]-双环肽7y可以以45%的转化率生成。中等大小的双环肽，如[3+4]环系的7f、[4+5]环系的7m和[6+4]环系的7s/7t可以以48%-78%的转化率得到。值得注意的是，各种官能团如吲哚（7l和7w中的Trp）、伯酰胺（7k和7r中的Gln）、胍（7j中的Arg）、硫醚（7g中的Met）、苯酚（7f中的Tyr）和醇（7p中的D-Ser）在这个条件下都可以得到兼容。N-甲基化是一种常用的改善环肽类药物性质的修饰方法，含有N-甲基残基的双环肽（7i、7k、7n、7o和7u）可以以36%-82%的转化率得到。上述研究结果表明，通过半胱氨酸促进的环化反应和酰胺缩合反应具有用于构建结构多样的DNA编码双环肽库的潜力。

^a转化率是从起始物料1开始计算的（总共9-15个步骤）；^b[m+n]：m为第一环上的氨基酸个数；n为第二环上的氨基酸个数，不包括半胱氨酸；^c颜色表示不同循环中使用的分子砌块（cycle 1：红色；cycle 2：绿色；cycle 3：蓝色；cycle 4：紫色）。

图5：各种环系大小的双环肽的普适性研究

为了确认双环肽的生成，团队通过可切断linker的方式合成了off-DNA双环肽化合物10（图6）。off-DNA产物10在ESI-MS中的Mass值（[M+H]+：1758.8322）与预期的Mass值一致，证明了双环肽的合成路径是成功的。为了进一步验证化合物10的结构，团队还通过固相多肽的合成方式合成了化合物10。通过LCMS和HPLC的数据分析与对比，可切断linker的方式和固相多肽的合成方式合成的化合物10具有一样的结构。

图6：在可切断linker上合成双环肽化合物

随后，团队利用qPCR实验证明了该反应不会造成显著的DNA损伤，表明了该反应对于大批量构建DNA编码双环肽库的适用性。

二肽、三肽和四肽作为分子砌块不仅可以增加环肽的尺寸，也可以增加环肽的化学覆盖空间。因此，团队通过酰胺缩合、De-Fmoc和缩合的方式评估了二肽/三肽/四肽在DEL库生产中的适用性。团队在HP-NH2上验证了543个二肽/三肽/四肽分子砌块，其中有420个分子砌块的验证结果是大于50%的转化率（图7）。考虑到HP-NH2和StBu-cysteine-HP反应活性可能有差异，367个二肽/三肽/四肽在StBu-cysteine-HP进行了验证，其中有293个分子砌块的验证结果是大于50%的转化率。二肽/三肽/四肽在HP-NH2和StBu-cysteine-HP上验证的总体通过率是一致的（≥50%转化率）。以上验证结果表明了二肽/三肽/四肽作为分子砌块在构建环系数大的DNA编码双环肽库中的潜力。

图7：二肽/三肽/四肽分子砌块的验证数据

综上所述，成都先导的团队开发了一种通过半胱氨酸的环化反应和酰胺缩合反应构建DNA编码的双环肽化合物的新方法。该方法具有反应条件温和、收率高、底物普适性广等优点，适合用于构建结构新颖的DNA编码的双环肽库。

成都先导深耕DEL领域多年，依托成熟的DEL技术，公司建立了一个基于非天然氨基酸驱动的类环肽的发现平台。该平台可以提供DNA编码类环肽库的设计与构建、DEL筛选、off-DNA的合成与优化，以及DEL衍生的类环肽在递送系统和蛋白-蛋白相互作用方面的服务。

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