科技前沿 | 可见光介导脱硫的C−C键生成反应用于构建DNA编码的环肽化合物库 发布时间：2024-12-06

近日，成都先导药物开发股份有限公司报道了一种通过可见光介导脱硫的C−C键生成反应，用于构建DNA编码环肽化合物库的新方法。该方法利用半胱氨酸前体与烯烃在可见光条件下进行关环反应，高效构建多种环系大小的环肽化合物。目前该成果发表于Organic Letters，题为《Synthesis of DNA-Encoded Macrocyclic Peptides via Visible-Light-Mediated Desulfurative C–C Bond Formation》

（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.orglett.4c04210）。

大环化合物¹分子量介于小分子和生物大分子之间，兼具两者的优势，比如具有良好的细胞膜通透性、良好的靶点选择性等，因此受到了学术界和工业界的广泛关注。DNA编码化合物库（DEL）技术比较容易引入非天然的氨基酸序列作为分子砌块，结合不同的关环方式，可以拓宽环肽化合物的化学空间和结构多样性²。数十亿级别的环肽分子库和高通量筛选的结合，使得DEL技术在环肽药物发现方面有着独特的优势。目前环肽DEL已用于不同靶点的筛选，发现了多个大环苗头化合物²。

合成环肽DEL库常用的步骤是先连接分子砌块，然后进行环化反应。环化反应的效率直接影响环肽化合物库的质量，因此科研工作者们在环化反应的开发方面投入了很大的精力。目前文献报道了多种on-DNA关环方法²，比如Wittig反应、铜催化炔烃/叠氮的加成反应、酰胺缩合、钯催化分子内S-芳基化反应、氰基-氨基与巯基的click反应、分子内苯并咪唑关环反应等。但这些方法主要是基于杂原子连接方式，而基于烷基链的环化方式的报道相对较少。近年来，Mitchell课题组³报道了半胱氨酸与烯烃在可见光介导下脱硫加成生成Csp³-Csp³的反应，实现了多肽的功能化修饰或环化反应。受此工作的启发，成都先导的团队经过研究，成功在DNA兼容的条件下实现了半胱氨酸前体与烯烃的反应构建DNA编码的环肽化合物（图1）。

图1：半胱氨酸前体与烯烃的反应构建on-DNA环肽的策略

成都先导的团队首先对on-DNA半胱氨酸（及其保护前体）与3-甲基-3-丁烯-1-醇的分子间反应进行了探索。通过对烯烃/TCEP/光催化剂的浓度、缓冲液和半胱氨酸前体等因素进行考察（Table 1），发现以1a’作为底物，在光照条件下可以以75%的收率得到目标产物3a（Table 1，entry 7）。

Table 1. on-DNA半胱氨酸与烯烃的分子间反应的条件优化

^a使用Gdn·HCl (6 M)和Na₂HPO₄ (0.1 M)作缓冲液；^b收率由LC-MS测定；^c使用PBS (0.2 M, pH = 7.5)作缓冲液。

基于上述半胱氨酸前体与烯烃的分子间反应结果，团队进一步把该反应用于on-DNA的关环中。团队利用DNA底物与S-叔丁基巯基-半胱氨酸、三肽和3-丁烯酸的多步缩合反应合成了on-DNA化合物7a（图2）。7a在优化条件下反应1 h，能以87%的收率得到关环产物8a。

图2：环化反应的路线验证

在上述关环反应得到验证后，团队对含有不同原子数的底物进行了考察。团队合成了7个不同长度的直链多肽底物并将其用于关环反应中。从图3可以看出，该反应能以60%-93%的收率生成十六元环产物（8b和8c），十九元环产物（8d），二十二元环产物（8e和8f）和二十五元环产物（8g和8h）。

图3：各种环系大小的环肽的普适性研究

在完成上述环肽的普适性研究之后，团队对烯烃的反应活性进行了研究。从图4可以看出，烷基类烯烃6b和6c能以良好的收率得到关环产物。当使用丙烯酸6d为底物时，并未得到关环产物8k。该反应体系比较杂乱，这也可能是由于丙烯酸活性比较高导致的。当使用苯乙烯类6e为底物时，同样并未观察到关环产物的生成，主要副产物是磷酸盐。该副产物可能是由反应体系中的一级/二级自由基被TCEP淬灭或者是苯乙烯与TCEP反应得到的。

图4：烯烃的普适性研究

随后团队考察了不同长度的多肽底物（9a-9e）与不同长度的酸-烯（6a-6c）的交叉反应情况。从图5可以看出，各种多肽与酸-烯的组合可以以41%-94%的收率得到关环产物。上述反应结果表明可见光介导脱硫的C−C键生成反应可用于构建含有16-30环系数的on-DNA环肽。

图5：多肽与酸-烯的交叉反应研究

为了探究线性环化前体中的半胱氨酸残基与烯烃的位置是否影响环化效率，团队合成了半胱氨酸在N-端、烯烃在C-端的on-DNA底物13。当将13置于关环条件下反应时，同样能够以63%的收率得到目标大环产物14。

图6：带有保护基的半胱氨酸在N-端，烯烃在C-端的底物的环化反应

考虑到脱硫副产物与关环产物具有一样的分子量，团队还通过on-DNA和off-DNA的方式对关环产物的结构进行了确认。从图7可以看到，on-DNA的关环产物跟脱硫副产物在HPLC上有明显的保留时间差异，因此可以通过分析HPLC确认关环反应是否顺利进行。同时，团队合成了off-DNA的关环产物18以及对应的脱硫副产物19。通过对化合物18与19的高分辨质谱、HPLC以及核磁的数据分析与对比，团队确认了关环反应成功进行并证实了化合物18的结构准确（图8）。

图7：on-DNA关环产物10g与脱硫副产物15g的HPLC对比图

图8：off-DNA关环产物18与脱硫副产物19的HPLC和1H NMR对比图

最后，团队利用qPCR实验证明了该反应不会造成显著的DNA损伤，表明了该反应对于大批量构建DNA编码环肽库的适用性。

综上所述，成都先导的团队开发了一种可见光介导脱硫的C−C键生成反应。该方法具有反应条件温和、收率高、底物普适性广等优点，适合用于构建结构新颖的DNA编码环肽库。

成都先导深耕DEL领域多年，依托成熟的DEL技术，成都先导的多肽平台（PCP）能够提供特殊氨基酸/多肽类分子砌块的合成、肽类偶联分子的合成、DNA编码肽类化合物库的设计与合成、肽类DEL库的筛选等相关业务。

参考文献：

(1) Ji, X.; Nielsen, A. L.; Heinis, C. Cyclic Peptides for Drug Development. Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202308251.

(2) Plais, L.; Scheuermann, J. Macrocyclic DNA-encoded Chemical Libraries: a Historical Perspective. RSC Chem. Biol. 2022, 3, 7.

(3) (a) Griffiths, R. C.; Smith, F. R.; Long, J. E.; Scott, D.; Williams, H. E. L.; Oldham, N. J.; Layfield, R.; Mitchell, N. J. Site-Selective Installation of Nε-Modified Sidechains into Peptide and Protein Scaffolds via Visible-Light-Mediated Desulfurative C-C Bond Formation. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202110223. (b) Griffiths, R. C.; Smith, F. R.; Li, D.; Wyatt, J.; Rogers, D. M.; Long, J. E.; Cusin, L. M. L.; Tighe, P. J.; Layfield, R.; Hirst, J. D.; Müller, M. M.; Mitchell, N. J. Cysteine-Selective Modification of Peptides and Proteins via Desulfurative C-C Bond Formation. Chem. Eur. J. 2023, 29, e202202503. (c) Smith, F. R.; Meehan, D.; Griffiths, R. C.; Knowles, H. J.; Zhang, P.; Williams, H. E. L.; Wilson, A. J.; Mitchell, N. J. Peptide Macrocyclisation via Intramolecular Interception of Visible-Light-Mediated Desulfurisation. Chem. Sci. 2024, 15, 9612.