先导科普荟 | 小分子及大分子药物生物分析种类及方法 发布时间：2024-10-21

前言

作为新药研发中不可或缺的一环，生物分析旨在研究生物分子、细胞和组织在各种生理和病理条件下的变化和功能，它涉及从基因组学到蛋白质组学，再到代谢组学的广泛领域，为生物医学研究提供了深入、全面的视角。在制药行业中，生物分析被广泛应用于药代动力学、毒代动力学、一致性评价、生物利用度、药效动力学等方面‌，通过深入研究生物分子的相互作用和功能，帮助科学家们更好地理解疾病的发病机制和药物的作用机制，为新药的发现、开发和优化提供了坚实的基础。

今天我们为大家介绍几种常见的药物分析检测方法：

1. 小核酸生物分析

小核酸药物的分析方法众多，不同的分析技术在定性、定量等不同应用场景中均有优势和不足。其中，LC-MS分析技术具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽和特异性强等特点，已成为主流的分析方法；液相色谱荧光检测法（LC-FLD）具有优异的灵敏度优势，是重要的生物分析补充方法。成都先导分析平台（下文简称“平台”）同时开发了LC-MS和LC-FLD方法，可完成寡核苷酸药物的体外稳定性评估以及体内药代动力学分析。目前平台检测的小核酸药物覆盖ASO、siRNA和Aptamer三大类型，完成了ASO-PO、ASO-PS、ASO-LNA、Dimer-ASO、siRNA-LNP、siRNA-GalNAC、C16-siRNA、siRNA-Aptamer等近30种不同修饰或递送基团的核酸检测。平台建立的LC-MS方法在体内组织样品中的定量下限可低至1.0 nM；利用PNA荧光探针开发的LC-FLD方法，其定量下限可低至0.05nM（图1）。

图1. 小核酸生物分析方法和定量下限

LQC:低浓度质控；LLOQ：定量下限；QC0:零浓度样品（含内标的处理过的基质）；Blank：空白样

2. ADC药物的DAR检测

ADC是将单克隆抗体通过偶联臂与小分子药物共价偶联形成的复合物，其以单抗为载体将小分子药物靶向运输至目标肿瘤细胞，进而发挥抗肿瘤作用。DAR是描述ADCs特征的一个重要理化参数，它决定了小分子药物的载量，影响着ADCs的安全性和有效性。DAR的分析方法包括紫外可见分光光度法、液相色谱法以及液质联用法等，其中质谱检测具有更高的灵敏度、特异性和准确性，对DAR的分析更具优势。平台基于Q-TOF开发了RP-LCMS法和SEC-LCMS法，可应用于变性条件和非变性条件下获得ADC药物的DAR值（图2）。

图2. ADC药物DAR值分析

3. 小分子药物生物分析

在过去30年里，LC-MS/MS凭借其特异性、灵敏度和分析速度方面的优势，一直是许多小分子药物分析的首选方法。然而，生物分析样本（如血浆、血清、组织、尿液和其他基质）含有的脂肪、糖和蛋白等内源性物质容易干扰目标物的检测，影响实验的准确性和重现性。为了应对这些挑战，平台开发了基于三重四级杆质谱体系和Q-TOF的LC-MS/MS方法，可解决生物介质样品干扰杂质多、浓度低、样品少等问题，具有良好的重现性、线性范围和信噪比。目前，平台的检测项目覆盖体外稳定性考察和体内组织分布项目，可承接的生物样品种类包括血清、血浆、肝、肾以及肿瘤组织等，定量下限低至2.0 nM（图3）。

图3. 小分子药物的定量分析

4. 小分子和多肽AS-MS

AS-MS是一种小分子药物发现的早期筛选方法，该技术利用活性小分子与靶蛋白间的亲和作用形成蛋白-小分子复合物，并通过特殊方法提取出复合物中的小分子，再配合高分辨率高灵敏度的质谱分析，完成目标配体的定性定量鉴定。相较于传统的高通量筛选模式，AS-MS可以做到上千个化合物混合筛选、一次分析的高效模式，效率大大提升。平台建立了小分子和多肽的AS-MS技术，利用磁珠法捕获蛋白-小分子复合物，通过洗脱得到复合物中的目标配体，再利用LC-MS鉴定目标配体（图4）；不仅如此，还可以利用LC-MS的定量技术进一步评价蛋白与配体的特异性结合能力。目前，平台已检测AS-MS样品40余批次，积累了丰富的分析经验。

图4. AS-MS筛选和定量分析

5. PEG和PEG-小分子定性分析

聚乙二醇（PEG）是一种被广泛应用于蛋白质和多肽等的共价修饰高分子材料。PEG化修饰是将PEG共价结合在药物上，以改善药物的药代动力学、药效学和免疫学特性，从而增强其治疗效果的一种药物技术。PEG可以增加蛋白质的溶解度和稳定性，也有利于药品的生产和存储，因此也常被用作药物递送系统和辅料。PEG和PEG化药物的生物分析，对于更好地控制不良反应以及设计更高效、靶向性更好的PEG化药物具有重要意义。LC-MS具有高灵敏度和选择性，并且相较于其他技术的开发时间更短，近年来被应用于PEG和PEG化药物的定性定量分析。平台开发了LC-MS方法检测PEG、PEG-官能团及PEG-小分子的分子量信息（图5），辅助判断PEG作为辅料或修饰基团是否符合安全性和有效性要求。

图5. PEG及PEG-小分子的分子量分析

6. 完整蛋白质分子量分析

分子量测定是生物药研发及生产中不可或缺的表征内容，在完整蛋白层面进行分子量测定可用于评估抗体药物结构完整性，获得药物抗体偶联比。实现蛋白质药物分子量测定依赖于高分辨率和高质量精度的仪器，质谱技术因其快速、准确、可实现相对定量的特点，已广泛应用于完整蛋白质的分子量确定。平台利用Q-TOF的高分辨分析能力建立了完整蛋白质分子量的检测方法，包括反相色谱(RP)、分子排阻色谱（SEC）以及质谱（MS）直接进样的方法，检测蛋白样品超过100个，涵盖了变性及非变性体系的检测手段，再经过质谱数据解卷积，为完整蛋白质分子量检测提供快速且直观的结果（图6）。

图6. 完整蛋白质分子量检测

成都先导分析平台介绍

成都先导分析平台凭借丰富的分析设备资源和药物分析经验，已成功开发出多种生物分析方法。检测对象覆盖：小核酸、小分子、多肽、聚乙二醇（PEG）以及蛋白质药物（图7）；检测项目包括：小核酸及小分子药物的体外稳定性考察和体内组织代谢分布，小分子和多肽的亲和质谱（AS-MS）分析，PEG及PEG结合小分子的定性分析，抗体偶联药物（ADC）的药物抗体偶联比（DAR）检测以及完整分子量计算。平台制定了严格的生物分析标准操作规程，实现了样本处理的标准化，确保样本分析的高质量。平台可根据客户的具体需求和项目特性，推荐最佳分析方案，为客户提供全面定制化的研发分析解决策略。

 图7. 成都先导分析平台业务范围

成都先导分析平台的设备资源

成都先导分析平台拥有多台高精设备仪器（图8），可提供高质量的检测数据，满足多类型样品检测需求。平台配置了四级杆飞行时间液质联用仪（Q-TOF），结合四级杆的质量过滤和离子传输能力，以及飞行时间器的高分辨率等多项技术优势，为分析人员提供高精度的质量检测和强大的质谱分析。高效液相色谱仪（HPLC）配备了5种检测器，包括示差、荧光、蒸发光、二极管阵列及质谱检测器，可覆盖大多数类型样品的检测需求。三重四级杆液质联用仪（Triple Quadruple LC-MS/MS）结合了液相色谱和三重四级杆质谱的分析技术，具有高灵敏度、高稳定性等多种技术优势，可监测样本中的基质干扰物、代谢物、杂质和降解产物，同时可以准确定量目标化合物，广泛应用于复杂样品的定量和定性分析。同时，平台还拥有超高效液质联用（UPLC-MS）、液质联用（LC-MS）和HPLC设备共30余台，能够满足客户的各类检测需求。

图8. 成都先导分析平台高精密仪器

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