DEL for G蛋白偶联受体配体发现 发布时间：2023-08-04

G蛋白偶联受体（GPCR）是一种具有典型的7个跨膜结构的多跨膜蛋白。它构成了一个大类的药物靶点家族，已有多种药物上市。鉴于制备具有正确构象的纯化蛋白有一定困难，传统的GPCR配体发现大多利用基于细胞的高通量筛选和虚拟筛选，在较少的情况下，利用纯化蛋白进行筛选。DNA编码化合物库（DEL）的筛选也在GPCR配体发现中有广泛应用，成都先导也采用了各种筛选方法来进行GPCR配体的发现。

基于细胞的筛选

基于细胞的DEL筛选已经被应用于GPCR靶点，特别是对于难纯化制备的靶点。DEL筛选的结合解离平衡过程主要是由靶标浓度主导，因此，细胞表面靶蛋白的表达量是筛选成功的关键。已有文献对GPCR靶蛋白表达水平和DEL分子富集比进行了直接比较（ACS Comb Sci. 2015 Dec 14;17(12):722-31），当表达量低于某个水平时，即使是nM亲和力的配体也无法被富集。此外，细胞表面蛋白的复杂性也加深了细胞筛选的难度，对于常规的基于蛋白质的筛选，靶标纯度可以被视为100%，然而，对于基于细胞的筛选，由于细胞表面各种其他蛋白的存在，靶标纯度可能低于1%。

虽然基于细胞的GPCR筛选有较大难度，但成都先导已在此方面进行了验证。通过在HEK293细胞上过表达靶GPCR，同时制作了一个阳性配体-DNA偶联物来进行筛选条件验证，并作为DEL筛选的阳参（图1）。DEL筛选富集了相对较弱的信号，信号对应的化合物被验证为具有uM效力的拮抗剂。

图1，A) 流式细胞实验确认了靶标GPCR的过表达。B) 在DEL筛选中成功富集了阳参DNA偶联物。

基于细胞膜的DEL筛选

准备高GPCR过表达细胞是耗时且相对难以实现的，因为高外源蛋白的表达可能对细胞造成影响且有时会阻碍细胞增殖。作为替代方案，基于细胞膜的筛选为GPCR的配体筛选提供了新的方案。GPCR在细胞膜中保持了其自然的构象，同时通过增加细胞膜量和标签固定等策略可进一步提高靶点量，并节省了从细胞膜中将蛋白纯化出来的工序。成都先导已经验证了基于细胞膜的GPCR DEL筛选，同时在实验中平行引入了去垢剂稳定的纯化蛋白筛选作为比较，两种筛选都富集了类似的DEL信号，且相应的化合物被验证为纳摩尔亲和力的结合分子（图2）。

图2，A) 基于细胞膜和蛋白的筛选富集了类似的信号。B) SPR验证DEL筛选的化合物为纳摩尔亲和力的化合物。

基于纯化蛋白的DEL筛选

由于跨膜区的疏水性，GPCR在水相溶液中易沉淀。因此，需要采用去垢剂、纳米盘和其他颗粒材料等不同策略来稳定蛋白使其在水溶液中保持正确的结构。去垢剂为GPCR提供了疏水保护，并在无脂质系统中保持蛋白质的正确构象，然而，去垢剂必须保留在下游的应用过程中以维持GPCR的构象。纳米盘为GPCR提供了和细胞膜更类似的环境，有时也能用来稳定一些更难制备的蛋白，但制备过程更耗时，同时纳米盘结构蛋白上的结合分子也需要在筛选中进行排除。成都先导已经进行了多次去垢剂/纳米盘稳定的GPCR筛选，采用光GPCR或与G蛋白复合物的GPCR进行筛选，鉴定了多种针对不同GPCR靶标的激动剂或拮抗剂。

图3，A) 在DEL筛选中使用的GPCR的不同形式。B) DEL筛选中的代表性苗头化合物的化学性质和活性。C) DEL苗头化合物的结构新颖性分析，分析方法参考文献(ACS Med Chem Lett. 2020 Nov 12; 11(11): 2114–2119)。

成都先导的GPCR DEL筛选

上述方法提供了GPCR DEL筛选的多种策略。基于纯化蛋白的筛选往往能提供更高的靶标浓度，且结合过程在更简单的环境中进行。如果可以获得稳定的纯化蛋白，那基于蛋白的筛选是GPCR配体发现的优先选择。如果纯化蛋白难以制备，那基于细胞膜和细胞的DEL筛选是可考虑的筛选策略。基于细胞的筛选使靶标蛋白保持在了天然的细胞状态中，不需要任何额外的蛋白制备操作，同时保留了互作蛋白和辅因子的相互作用，是GPCR筛选的理想状态，但靶蛋白高表达的细胞制备可能难以达到。因此，基于细胞膜的筛选提供了另一个方案，在此状态下靶点保持在天然的细胞膜中，同时可以通过后续操作富集靶蛋白提高靶点浓度。

成都先导在GPCR筛选方面有着丰富的经验，提供多种针对不同GPCR的DEL筛选策略，根据靶点本身的特征量身定制筛选方案，助力GPCR配体发现和药物开发:

●  细胞/细胞膜/蛋白模式提供了多种筛选方式。

●  不同的蛋白区域和形式使筛选得以区分不同的结合位点或激动/拮抗机制的化合物。

●  大的DEL库为筛选成功提供了保障，尤其是孤儿受体等无已知配体的GPCR。

●  快速筛选时间和多成功案例。