先导科普荟 | 降解疾病蛋白的全新组件——TRIM21 发布时间：2023-04-25

背景介绍

泛素化蛋白酶体系统（UPS）是一种高度进化保守的细胞机制，在真核细胞的蛋白稳态调节中发挥着最主要的作用。UPS主要由泛素蛋白ubiquitin、泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3（以下简称“E3连接酶”）以及26s蛋白酶体所构成，各组成元件相互协同，完成目标蛋白的识别、泛素化及降解过程。除了参与蛋白的稳态调节，泛素化与体内的各种生物过程密切相关，包括内化和溶酶体靶向、蛋白质相互作用、亚细胞分布变化、转录调节、生长反应、先天免疫反应、DNA修复和复制以及跨膜信号转导。人体内总共有600多种E3连接酶，通过特异性的底物识别机制，构成蛋白泛素化修饰的多样性。

蛋白降解药物研发已经逐渐从实验室阶段的概念验证，走到了临床阶段的系统性研究，在多种癌症及炎症患者身上展示出强大的药效。但是，目前所有已披露的临床蛋白降解项目均利用了CRBN或者VHL这两种广泛组织表达的E3连接酶，这显然无法突破由on-target毒性带来的靶向药物在临床应用的限制，并且导致了蛋白降解药物分子IP拥挤的研发困境。为此，开发组织差异表达的E3连接酶配体成为蛋白降解领域的热点研究。成都先导利用自有的蛋白降解平台，已经在E3连接酶配体开发中初现成果，并且进一步证明了DNA编码化合物库技术（DEL）在E3连接酶这类难成药靶点上的巨大能力。

新颖E3案例研究

成都先导针对潜在具有靶向蛋白降解应用价值的E3连接酶研究，建立了自有的评估及验证体系，包括1）组织分布差异性E3连接酶的生物信息学分析，2）单体及复合体蛋白表达（成都先导商品化E3连接酶蛋白请查询：https://www.labome.com，选择对应的“Protein”类别），3）DNA编码化合物库筛选驱动的配体发现，4）配体分子结合及降解验证，5）降解机制验证。经过数据库分析，TRIM21（三元基序家族成员，参与自身免疫性疾病、肿瘤的发展和预后）显示在多种肿瘤细胞中，如胰腺癌细胞、脑胶质瘤细胞等呈现较高表达。目前已知TRIM21能够介导细胞凋亡相关蛋白VDAC2、糖酵解蛋白HIF1a等的UPS依赖性蛋白降解。因其抗体依赖性的活化机制，TRIM21被开发用作Trim-Away的工具，通过抗体识别底物蛋白可以实现多种细胞中不同蛋白的降解。在此基础上，我们提出利用PROTAC分子，同样能够实现诱导TRIM21与特定靶点蛋白的结合并最终导致蛋白降解。本文有关细胞水平的概念验证，有望发现一个更够适用于广泛靶点降解的E3连接酶工具，且具有组织靶向的特异性。

TRIM21结构域特征及酶学特征表明其E3连接酶的活性激活是一个高度有序的过程。TRIM21含有N-端RING结构域，中部的coiled-coiled结构域，介导同源二聚体的组装，以及C-端PRYSPRY结构域，参与底物蛋白的识别与相互作用。基于E3连接酶配体开发的项目经验，我们选定TRIM21 PRYSPRY结构域作为蛋白降解剂招募的最佳区段，进行万亿级DNA编码化合物库的筛选，快速合成并通过SPR实验验证得到TRIM21的高亲和力配体分子（Kd^~100 nM）。据我们所知，这是首个TRIM21的小分子配体，其快速的发现过程得益于成都先导万亿级DNA编码化合物库高效且高质量的筛选和验证技术。

为探索由E3连接酶差异性分布所带来的降解差异性，我们在不同肿瘤细胞中对比了TRIM21与CRBN介导同一底物BRD4降解的能力。其中，在胰腺癌细胞PANC1与皮肤癌细胞A431中，TRIM21的降解能力均优于CRBN。而在乳腺癌细胞MCF-7及正常细胞HEK293中，TRIM21几乎不引起明显的BRD4降解，而基于CRBN的PROTAC能实现高效的降解，进一步阐释了E3连接酶酶介导降解的细胞差异性，并且印证了选取特定组织表达的 E3连接酶有望规避正常组织的降解功能，从而实现更好的安全性。

为阐释细胞差异降解的原因，我们对TRIM21降解敏感细胞PANC1、A431及不敏感细胞MCF-7、HEK293进行了E3连接酶的内源表达的表征。结果显示，TRIM21在2株鉴定的敏感细胞中均为高表达，而在2株不敏感细胞中均为低表达。同等的规律，也符合不同细胞中CRBN的表达与降解敏感性的关系。在之后进行的降解机制验证实验中，我们发现TRIM21介导的BRD4降解效应，在加入TRIM21配体分子、BRD4配体分子竞争以及蛋白酶体抑制剂的样品组均能抵消，证明了降解的TRIM21 E3连接酶以及UPS依赖性。

应用拓展

为了探索更多的蛋白降解靶点空间以及E3连接酶的潜在特异性组织靶向性，我们将上述验证完成的TRIM21配体分子，通过成熟的化学反应组装成可以直接用于PROTAC分子合成的工具包。对此新颖E3感兴趣的蛋白降解研发专家可以与我们联系（[email protected]），我们将对TRIM21介导的蛋白降解项目展开快速的POC验证，共同探讨差异化降解的价值。