体外hERG评价——加速药物早期研发，降低潜在临床风险 发布时间：2022-04-07

成都先导新药研发体外生物学团队

作为制药产业的核心环节之一，新药研发往往耗时长、投入大、成功率低。对于新药研发人员而言，最怕的莫过于突破重重困难筛选得到的新化合物由于各种原因在临床阶段遭遇失败。一份早期的研究显示，超过90%的药品退市和三分之一进入I-III期临床研究的开发项目终止都是由于药物毒性导致，其中肝毒性和心血管毒性占主要比例^[1]。

本文介绍的hERG（human Ether-a-go-go Related Gene）便与心血管毒性有关。如图1^[2]所示，药物抑制hERG通道或其他疾病（如LQTS）导致快速延迟整流电流（I_Kr）阻断，造成心脏动作电位时程中QT间期延长，心室复极化延迟，进而诱发尖端扭转性室性心动过速（TdP），严重时可引起突然死亡。由hERG基因编码的Kv11.1钾离子通道传导I_Kr，在整个动作电位时程中起到至关重要的作用。

图1：hERG与TdP

hERG通道的高度混杂性质使它有可能容纳大量不同的配体。最近，一项研究对约30万种不同化合物进行了高通量分析，其中27%的化合物在10μM浓度时显示出对hERG的抑制作用^[3]。因此，近年来各国药物监管部门规定，新化合物必须按照相关指南标准进行全面的hERG活性和QT间期评价，以尽早有效地进行预测、评价和优化，避免药物对hERG钾通道的抑制活性。

       目前，体外hERG评价方法主要有三类：

1. 电生理

以膜片钳技术为代表技术。传统膜片钳技术（或手动膜片钳技术，Manual patch-clamp assay）利用微电极记录细胞内跨膜电位，被公认为是离子通道研究的“黄金标准”，也是最精确的测量离子通道的实验方法，适用于研究化合物与离子通道作用的作用机制，亦可用于新药申报过程中候选药物的毒性评价和先导化合物的结构优化。但此项技术对操作人员的技术要求较高，且通量低，无法满足目前药物研发对hERG毒性评价的大量需求。近年来，出现了一些自动化的电生理（如全自动膜片钳，Automated patch-clamp）检测方法及设备，检测通量得到了极大提高，且相对于手动膜片钳结果具有较好的可比性。不过，自动化电生理平台会受到仪器和耗材的高成本的限制。

图2：膜片钳技术

2. 基于细胞荧光的检测方法

荧光染料和酶标仪的技术发展为高通量筛选离子通道活性提供了另一种途径。

一类荧光膜电位指示剂可用于监测膜电位变化，但由于这些膜电位测定方法缺乏敏感性，容易导致“假阴性”问题。此外，这种方法的结果与电生理法的结果存在排序差异。

另一类铊（Tl⁺）浓度敏感的荧光染料，提供了一种更直接的hERG活性测定方法^[4]，离子通道开放后染料荧光强度随Tl⁺浓度升高而增强（如图3所示），其优点是适用于高通量筛选。但测试化合物和染料之间可能存在相互作用，进而导致荧光信号猝灭。

图3：Tl⁺ flux assay

3. 配体结合检测方法

配体结合测定已广泛应用于离子通道调制剂的筛选，主要代表方法有放射性配体结合检测方法（Radio-ligand binding assay）以及荧光偏振检测方法（Fluorescence polarization assay）。

图4：荧光偏振技术检测化合物与hERG结合

配体结合实验检测化合物与离子通道的结合亲和力，通常使用分离的细胞膜进行，通过检测待测化合物与标记配体对hERG通道上配体结合位点的竞争结合来表征化合物结合力^[5]，如图4展示的使用荧光偏振技术检测配体结合。配体结合是非功能性分析方法，因此不能识别离子通道的功能变化，也无法区分化合物是激动剂或拮抗剂，需要使用其他功能检测方法进行二次确认。尽管配体结合方法不能直接提供离子通道功能的直接度量，但可以使用常规仪器进行高通量分析，且得到的IC50值与膜片钳技术得到的IC50值有良好的相关性^[6-8]（如图5所示）。临床前药物发现过程中，使用配体结合等方法尽早地筛除潜在的毒性化合物，从而指导候选药物的选择，可大大减少后期临床的开发时间和成本损耗。

图5：荧光偏振技术与膜片钳技术的检测结果相关性分析

成都先导已经建立了稳定的hERG高通量筛选方法（结果示例如图6所示），可快速剔除临床风险化合物，大大降低项目前期成本，加快项目推进。

图6：hERG阻断剂E-4031检测结果32nM，与文献报道结果^[8]一致

参考文献：

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