基于定向DNA 编码化合物库的化合物活性优化策略 发布时间：2020-04-24

潜在活性分子快速优化为有更好活性或成药性的先导化合物仍是存在于药物研发中的挑战之一。传统的苗头化合物优化方法通常需要多轮优化与准确的构效关系（SAR），耗时长、成本高。基于DEL技术在药物筛选中的优势，通过SAR信息与计算机模拟方法并针对特定靶点设计合成小型定向DNA编码化合物库，将DEL技术用于药物化学的design-make-test-analyze（DMTA）循环中，能够有效提升苗头化合物优化效率。与经典的H2L优化方法相比，定向DNA编码化合物库能快速通过单个或组合位置扫描完成结构优化，其本质上是对与靶点具有一定特异性亲和力的分子结构进行预富集。

Casey课题组近日报道了基于定向DNA编码化合物库的苗头化合物优化方法，通过合成模拟肽分子库并对多个同源ChDs进行体外亲和筛选，获得了具有细胞透膜性的CBX8 ChD选择性抑制剂。

多梳蛋白家族（Polycomb group, PcG)）是一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子，从生化和功能上它可以分成两个主要的核心蛋白复合体PRC1 (Polycomb repressive complex 1) 和PRC2 (Polycomb repressive complex 2)。其中PRC1由PCGF、PHC、RING 和CBX ChDs四个同源蛋白组成。研究发现CBX ChDs蛋白不仅控制个体正常的发育模式，而且与细胞的增殖、分化和肿瘤发生有关，在多种恶性肿瘤中具有高表达。

图1典型多梳蛋白介导的基因抑制机理

CBX8由于其结合位点具有灵活性高、口袋浅、与CBX ChDs同源性高的特点，目前尚无选择性的化学探针或抑制剂报道。为了寻找高活性、高选择性和细胞透膜性的CBX8抑制剂，作者以先前报道的KED98为起始苗头化合物进行结构优化，该化合物对CBX8 ChD的IC50=14±1μM，但是对其他CBX ChDs选择性差、透膜性低。为了提高KED98的选择性和透膜性，作者构建DNA编码位置扫描化合物库并通过亲和力筛选最终发现了SW2_110A（Kd = 800 nM），该化合物对其他CBX ChDs至少具有5倍的选择性，细胞透膜性得到大幅度提升。

图2 起始苗头化合物KED98

首先作者设计并合成了第二代DNA编码位置扫描化合物库（PSL2）。将KED98分为四个部分即P1、P2、P3和P4，通过保持其余部分不变，改变其中一个部分或合并两个部分对KED98进行SAR和选择性研究（图2）。合成的PSL2库包含了192个分子，其中P1-P4各有32个building blocks，P[-1+-2], P[-2+-3], P[-3+-4]和P[-4+acetate cap]各有16个building blocks。按照图3所示的流程对合成的编码化合物进行了亲和力筛选。

图3 DNA编码库的建库及筛选流程

第一轮筛选的结果显示了不同位置被取代的SAR信息。在P1位置，有更多的亲脂性氨基酸富集，进一步分析数据发现，P1位置不能提高对CBX8的选择性。对于P2位置，发现小的疏水基团取代如（PSL2A_49-80）对所有CBXs均兼容，非α-氨基酸对部分CBXs不兼容；大的基团取代如（PSL2A_75）对CBX8具有更好的选择性。对于P3位置，苯基及其类似物如（PSL2B_10, PSL2B_13, PSL2B_15）优先富集。对于P4位置，异恶唑及其类似物包括芳杂环取代对不同的CBX均有富集。将P1和P2合并为单个氨基酸（PSL2A_33-48），除了（PSL2A_35）均没有信号富集，但是后来的Off -DNA研究证明（PSL2A_35）为假阳性。同样将P2和P3合并也无信号富集。而将P3和P4合并后，P[-3+-4]中的（PSL2B_42和PSL2B_48）保持了活性同时也提高了选择性。虽然这次针对不同CBXs 的筛选出现了选择性较好的富集信号，对比PSL1（SLAS Discov., 2018, 23(5): 417–428）的筛选结果和活性测试结果发现，PSL2A_50和PSL2A_49在活性上区有明显区别，但是在本次筛选中富集信号并没有被有效区分，因此作者怀疑是筛选条件不够严苛导致的。

图4 第一次筛选结果

为了提高亲和力配体在筛选中的区分度，作者增加了筛选洗脱的次数和时间，同时降低筛选蛋白的浓度。经过筛选后，P(–2) PSL2A_50的缬氨酸比PSL2A_49的环戊基有更高的富集，这种富集与PSL1（SLAS Discov., 2018, 23(5): 417–428）筛选结果相符合。通过更严苛的筛选后，不同亲和力的分子在信号上具有更好的区分度，对P(–1) 或者P(–3)位置进行取代，无明显信号富集，对P(-2) 和P(-4)的取代，具有比阳性更好的信号富集。

图5 第二次筛选结果

作者以第一次筛选的结果评价不同库分子对不同CBXs的选择性（图6），以第二次筛选的结果分析不同库分子对CBX8亲和力大小（图6），结合两次筛选结果最终挑选了5个化合物进行重合成，并用竞争性荧光偏振实验分别测试了5个化合物对CBX6、7 与8的活性。其中P2位被环戊烷（PSL2A_52）和环丙基（PSL2A_57）取代，对CBX8的活性有5-7倍的提高，但对CBX6和CBX7的选择性降低。P2位被苯基（PSL2A_75）取代对CBX6和CBX7的选择性提高，活性降低3倍。当P3和P4被烷氧基联苯甲酸（PSL2B_48）和联苯甲酸（PSL2B_42）取代后活性保持不变，对CBX6和CBX7的选择性有很大的提升。这些结果与DNA亲和力筛选时富集的信号保持了一致。进一步作者选取部分化合物测试其Kd值，结果显示SW2_110A-FL（烷氧基联苯甲酸）对CBX8的Kd = 800 nM。值得注意的是，作者发现去掉骨架的P4部分仍然保持了对CBX8 ChD的活性，并且选择性得到大幅提高。将这种去掉骨架P4部分，然后加上氧联苯酰基化后，得到了CBX8 ChD 选择性的抑制剂SW2_110A 。作者接着结合NMR和MD，对这种选择性给与了结构上的解释。这对于基于结构设计选择性的CBX 抑制剂具有重大意义。更重要的是，相比于起始化合物，去掉P4部分的氨基酸不仅降低了分子量，同时降低了可旋转键的数量，增加了疏水性，进而提高对细胞的透膜性。最后作者用优化得到的CBX ChD抑制剂，证明在MLL-AF9白血病中，CBX8的ChD 是CBX8介导HOXA9基因激活所必需的。

图6 活性测试结果

作者通过定向DNA编码化合物库进行构效关系研究、筛选与重合成试验验证获得了具有选择性、细胞透膜性的模拟肽CBX8 ChD配体。该配体是迄今为止针对CBX8 ChD具有紧密结合且选择性最好的抑制剂。DEL技术已经被广泛用于药物早期发现筛选苗头化合物，该工作进一步证明了可以将DNA编码化合物库的技术用于药物化学DMTA循环中。相比于传统的单个分子的合成、纯化和活性测试，作者发现这种通过DNA编码化合物库的方式来进行化合物筛选和活性优化，能探索的化合物空间较大，相对时间较短且成本较低。这些优点更多是由于体外筛选的本质决定的。这种快速有效的实验允许同时对多个蛋白靶点并行地进行亲和力和选择性的筛选和优化。DEL库的筛选是蛋白浓度驱动结合的过程，因此DNA编码的分子浓度不是主要影响因素，其浓度与需求量较低，并且可以将不同分子混合在一起进行筛选，对蛋白的需求量大大地减少，这一点相比于传统的药物化学就显得更为经济。尽管配体的纯度会使得富集信号与配体亲和力之间的相关性变得复杂，但是在给予不同的浓度筛选后，这个问题就会得到解决。已经有许多研究证明筛选试验富集信号与配体亲和力之间具有一定相关性。

作为一家创新型小分子药物研发企业，成都先导致力于以DEL合成和筛选为核心的技术开发。为进一步提升苗头化合物优化效率，成都先导以筛选发现的苗头化合物或报道的活性化合物作为起点，基于定向DNA编码化合物库的化合物活性优化策略，针对数个靶点设计合成了定向DNA编码化合物库，并成功获得了具有新颖结构且活性更优的候选化合物，有望给DEL技术在药物化学中的应用带来新的突破。